论文｜猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

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作者：潘孝成^1,2，沈学怀^1,2，赵瑞宏^1,2，戴银^1,2，胡晓苗^1,2，侯宏艳^1,2，周学利^1,2，张丹俊^1,2*

单位：1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所；2.安徽省畜禽疫病研究中心

简介：潘孝成，助理研究员，博士，从事畜禽传染病研究。*通信作者， 研究员，从事畜禽传染病研究。

基金项目：安徽省科技重点研发项目（1704a07020066）；安徽省农业科学院平台项目（2019YL065）；安徽省农业科学院创新团队项目（13C0405）；安徽省生猪产业技术体系项目（AHCYTX-05-09）；安徽省科技重大专项（17030701008）。

OSID开放科学计划

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea Virus，PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，可导致一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的猪传染病。1971年首次在英国发现猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED），我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道。

2010年底开始，PED在我国呈暴发性流行，流行广泛，主要表现为各年龄段猪均可发生腹泻，成年猪一般只表现为腹泻症状，仔猪死亡率高，10日龄内仔猪死亡率可达100%，给众多养猪场（户）带来了巨大的经济损失。PEDV M基因由681个核苷酸组成，编码226个氨基酸。研究表明，M基因与PEDV病毒的组装和出芽以及诱导α干扰素的产生等有关。

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目的

对安徽省PEDV安徽流行株的M基因进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析，以期了解安徽省猪流行性腹泻病毒的遗传变异，为PED的防控提供依据。

方法

对采自安徽省境内疑似发生猪流行性腹泻的猪场（2013—2017年）的5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。试验所用参考毒株序列见表1。

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结果

◆RT-PCR扩增结果和测序结果

取PEDV胶体金抗原检测试剂检测为阳性，且来自安徽省不同地区7个猪场的样品用引物对P₁、P₂进行进行PCR扩增，电泳结果显示均扩增出约715bp的基因片段（图1），与预期结果相符。测序结果显示，获得7株PEDV流行毒株的M基因序列，序列全长均为681个核苷酸，编码226个氨基酸，其中有2对流行毒株的基因核苷酸序列完全相同，将核苷酸序列不同的5株分别命名为AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH。

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注：M为DL 2000 Marker；1为阴性对照样品；2~8为阳性样品

图1 PEDV M基因的PCR扩增结果

◆PEDV M基因核苷酸同源性分析

将该试验获得的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）进行M基因核苷酸序列同源性分析，结果见图2。

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注：右上三角数据为核苷酸序列同源性；左下三角数据为遗传距离

图2 PEDV M基因核苷酸序列同源性分析

从图2可以看出，5株安徽地方流行毒株M基因核苷酸序列同源性为99.1%~99.9%，与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）序列同源性较低，为96.9%~98.2%；5株地方流行毒株M基因核苷酸序列与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）序列的同源性较高，为99.0%~100%，其中同源性最高的是AH-SH与美国分离株IA2以及我国分离株GD-B，均达100%。

◆PEDV M基因遗传进化分析

将该试验得到的5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与参考毒株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、CHS、LZC、attenuated DR13、IA2、S12、MEX-GTO、CV777）的M基因核苷酸序列进行系统进化树分析，结果见图3。

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图3 PEDV M基因的核苷酸序列进化树分析

从图3可以看出，进化树分为Ⅰ和Ⅱ2个群，I群包括CHS、LZC、attenuated DR13和CV777，Ⅱ群包括5株安徽地方流行毒株及GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12和MEX-GTO。这表明5株安徽地方流行毒株（AH-FD、AH-SX、AH-GD、AH-SD和AH-SH）与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的亲缘关系较远。

结论

结果表明，5株安徽地方流行毒株间以及其与2011年后的国内外分离株（GD-B、CH-FJND、CH-BJ2、CH-GDGZ、V7-HB2018、IA2、S12、MEX-GTO）的核苷酸序列同源性均较高，与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）的序列同源性较低，亲缘关系也较远。

这说明一方面2011年前后的PEDV分离株存在相对较大的差异，且2011年后 PEDV的国内外主要分离株M基因差异不大，另一方面PEDVM基因具有高度保守性（核苷酸序列同源性为96.9%~100%），2011年后分离株虽然与此前毒株的基因序列存在相对较大差异，但这种差异是否影响了M蛋白功能仍需进一步研究。

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采编：小白

排版：小同

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