猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

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本文是《猪肠型大肠杆菌病的诊断、治疗和耐药性》的第二部分，主要介绍猪肠型大肠杆菌病的诊断方法，组织病理学特征以及鉴别诊断方法。

1 诊断方法

新生仔猪和断奶仔猪肠型大肠杆菌病的诊断包含不同诊断程序的联合应用，从观察临床症状和眼观病变开始，随后进行适当的细菌学调查以及对分离的细菌菌株定性。

1.1 临床症状、眼观病变和采样

由于肠毒性大肠杆菌造成的新生仔猪腹泻最常见于0～4日龄的仔猪，通常呈地方性流行；头胎母猪所产仔猪可能更容易感染，因为它们缺少被动免疫的保护（所以头胎母猪一般建议产前进行两次疫苗免疫）。

由大肠杆菌造成的断奶仔猪突然腹泻，通常见于断奶后2周～3周的仔猪，但是见于断奶后6周～8周的仔猪也并非特例。

当肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)造成新生仔猪腹泻时，我们可以观察到发病仔猪会出现大量水样或含有凝乳块的腹泻，散发出特征性气味，颜色通常呈白色或黄色。

由ETEC引发的断奶仔猪大肠杆菌病通常以淡黄色、灰色或淡粉色水样腹泻和特征性气味为主，病情通常持续1周(图1)。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

图1 发生ETEC F4型断奶后腹泻的仔猪粪便样本

感染猪通常表现为精神沉郁、食欲减退和被毛粗乱黏湿。发病猪可能会出现突然死亡，尤其是在疾病暴发伊始。死猪通常脱水，且眼窝深陷；小肠通常扩张、轻度水肿和充血(见图2)。新生仔猪或断奶仔猪发生大肠杆菌病后，胃通常膨胀，且分别充满凝乳块或干饲料，基底部充血(图3)。肠系膜淋巴结肿大，且通常充血。这些病变虽然不具有特异性病征，但仍提示肠型大肠杆菌病。因此，对患有大肠杆菌病的新生仔猪和断奶仔猪进行剖检，可帮助病理学者选择后续的实验室检查方法。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

图2 一头发生ETEC F4断奶后腹泻的仔猪肠道出现膨胀、水肿和充血

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

大肠杆菌导致的肠炎，乳糜管清晰可见

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

注：胃底出现严重的充血

图3 发生ETEC F4 断奶后腹泻的猪胃

最有效的方法是选择腹泻、发病时间不足12h～24 h的一定数量(3头～5头)的未治疗病猪，处以安乐死并进行精准剖检，从而评价眼观病变(评价小肠、结肠、回肠瓣膜、肠系膜淋巴结)并采样。采集未剖开且两端系扎的小肠(尤其是回肠和空肠)和大肠样本，并送至实验室(新鲜样本用于细菌学检验，10％福尔马林缓冲液固定的样本用于组织学检查)，细菌学检验要求分离引发疫病的致病性大肠杆菌菌株，定量(进行或不进行纯化培养)、定性和评估对抗生素的敏感性(图4)。新鲜样本应当在4 ℃下储存，且应在采样后 24 h内送达实验室保存。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

近期自发死亡的仔猪也可以用于微生物学分析。由于机体死亡后消化道会迅速自体分解，因此从死亡后4 h～6 h的仔猪上采集的组织样本通常不适合进行组织病理学分析。如果安乐死或近期死亡的猪未表现出肠型大肠杆菌病的典型临床症状，建议对3头～5头猪采集粪便样本(直接从动物体内采集，而不是采集排泄在地板上的粪便)或直肠拭子(图5)。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

对多种检查结果汇总后方能确诊，包括：细菌学定量测定、致病因子鉴定(通常采用PCR方法)，以及将病理学检查作为补充分析，从而对观察到的显微病变与检测到的病原进行综合的判读。图5列出了在诊断肠型大肠杆菌病时应当遵循的诊断树状图和诊断标准。

1.2 细菌分离株的细菌学检测和鉴定

肠型大肠杆菌病的诊断是以肠道管腔内容物(首选)或直肠拭子样本的细菌学检测为基础的。样本应接种于血琼脂和麦康凯琼脂或者其他对肠杆菌科细菌具有选择性的培养基，如HE琼脂。这些选择性培养基可以将能够发酵乳糖(如大肠杆菌)的与不能发酵乳糖的革兰氏阴性肠杆菌区分开。固体培养基上的菌落在培养1 d内达到它们原有的大小，有光滑型或粗糙型或黏液型的区别。血琼脂上菌落的生长特征以及在选择性培养基上的乳糖发酵能够给出第一个判别性标志。特别是，不仅在新生仔猪腹泻上而且在断奶仔猪腹泻中，溶血菌落的存在通常被用作ETEC腹泻的快速诊断工具(图6)。总的来说，从新生仔猪大肠杆菌病病例中分离的ETEC在血琼脂平板上可能会出现溶血(ETEC F4阳性)或非溶血(ETEC F5、ETEC F6和ETEC F41)菌落。从断奶仔猪腹泻病例中分离的ETEC虽然也可观察到非溶血菌株，但大多数为溶血菌株(ETEC F4或ETEC F18)。在最近的一项研究中，研究人员报告称从鉴定为ETEC的断奶仔猪腹泻病例中分离到的大肠杆菌菌株有97.6％为溶血菌株。剩余的2.4％非溶血ETEC分离株在法国、意大利和德国分离到，拥有相同的致病型别：F4、STa和STb，这些分离株全部进行了溶血活性检测。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

注：图片显示出溶血性大肠杆菌在血琼脂上的一个纯培养物

图6 从发生断奶后腹泻的猪肠道内容物中分离的ETEC F4菌株

检出致病菌株并不说明该病存在于每个病例中，当然，正如上述报道中的那样，致病性大肠杆菌也可能从健康宿主的肠道栖居环境中分离到。

因此，对诊断结果的评估，只有在同时考虑了临床症状和病理学观察结果这两种情况后，再结合分离到的致病性大肠杆菌的定量分析结果才能给出。因此，分离自小肠(回肠和空肠)的纯培养物或接近纯培养物中高浓度的致病性大肠杆菌是肠型大肠杆菌病的标志。由于几乎所有的ETEC F4或ETEC F18都是溶血的，出现溶血菌落纯培养物可以作为新生仔猪大肠杆菌病(ETEC F4)或断奶仔猪大肠杆菌病(ETEC F4或ETEC F18)的假定性诊断依据。

对用抗生素治疗的动物其细菌学检测阴性结果的判读不可靠，因此需要对未治疗猪进行重新检查。

鉴定分离株编码菌毛和毒素的毒力基因，对于确定其在所观察到的临床症状中的作用至关重要。当前，在诊断程序中，许多实验室用基因型分析[如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)]检测编码毒力因子的基因，从而对该分离株定性。市场上已经提供可识别ETEC编码毒素(STa、STb、LT和EAST1)和菌毛(F4、F5、F6、F18和F41)、肠道致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)外膜蛋白族或黏附素、产志贺毒素大肠杆菌STEC(与水肿病有关的大肠杆菌)菌株Stx2e毒素的基因引物，并可用于PCR以进行日常诊断。有趣的是，某些F18菌株既能产生肠毒素又可产生Stx2e毒素。这些菌株被归为ETEC而非STEC，因为它们在临床上引发的断奶仔猪腹泻远多于水肿病。

应用终点PCR直接鉴定病猪样本中毒力因子，而不是对各个分离株进行半定量细菌学检测和分型，可能会使判读变得困难且不可靠。这种诊断方法并不能对病原进行定量，可以给出属于出现在样本中的各种大肠杆菌菌株的所有可检测毒力因子的混合结果，结果无法将这些因子组合起来。此外，不能排除检测到其他肠杆菌科细菌的相似毒力因子基因。例如，对分离自墨西哥儿童腹泻病例的细菌菌株进行的研究表明，一株被鉴定为M. morganii菌株的ST毒素基因与大肠杆菌的一个ST毒素基因100％相同。研究人员先前报道的可编码LT毒素的基因属于从腹泻游客粪便样本中分离的M. morganii菌株。

定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)的发展已经成为一项可以单独进行或与细菌学检测一起进行的切实可行的诊断方法。St?hl和其同事报道，当与培养来自腹泻猪粪便样本中的大肠杆菌F4和E18方法相比较时，此qPCR方法具有更高的灵敏性。细菌培养法未能检测到致病性大肠杆菌，而采用此方法后，34％的样本呈F4-qPCR和/或F18-qPCR阳性。当检测到的大肠杆菌F4和/或大肠杆菌F18含量高于107 CFU/g时，表明培养了大量的条件致病性大肠杆菌。虽然用qPCR对致病性大肠杆菌进行定量检测是一种诊断肠型大肠杆菌病的有应用前景的方法，但是半定量细菌学检测方法对于引发大肠杆菌病的大肠杆菌菌株的分离和抗菌药敏感性实验仍具有至关重要的作用。

通常，F4阳性大肠杆菌的暴发，在任何时候往往只有一种菌株参与，哪怕我们在同一次暴发中观察到了混合感染且分离到了不同的致病型别菌株。在这些病例中，一种致病型别菌株很可能在任何暴发中占据着主导作用。因此，最合适的做法是，在定量细菌学检测之后且与检测成本相称的情况下，对从发病猪群中不同猪上分离到的更多分离株进行分型，从而确定某一次暴发的肠型大肠杆菌病病例是否涉及一种以上的致病型别。例如，明智的做法是检测来自5头典型腹泻猪的样本，并对根据培养和生化特性选择的3个分离株进行定型。虽然，这种方法不会给出确切的结果，但是其的确会提高所获结果的可信度。

在断奶仔猪腹泻暴发期间，研究人员按照上述报道的采样方法对欧洲160个猪群进行了一项研究，结果研究人员在该次暴发中观察到了13％的患病猪有混合感染(ETEC F4和ETEC F18)(数据未公开发表)(图7)。

致病性大肠杆菌也可以通过O抗原(细胞壁LPS)的血清分型进行鉴定，因为少数特异性O血清群能够引发该病(表1)。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

H抗原(鞭毛蛋白抗原)和O抗原的所有血清分型，以及除此之外K抗原(荚膜多糖)的鉴定，是所有血清型标准的鉴定方法，但是通常在少数参考实验室中进行。

一个血清群中不同的菌落可能已经进化，产生了不同致病基因，造成与特定地区或国家有关的克隆变异。例如，与全球范围内菌毛F18 ab相关的ETEC O139血清群，通常会在澳大利亚引发断奶仔猪腹泻，在欧洲引发猪的OD，而与世界范围内猪中的断奶仔猪腹泻相关的优势血清群是O149(表2)。

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2 组织病理学

对福尔马林固定、石蜡包埋的组织(应该包括回肠、空肠和大肠)进行组织病理学检测可以用作大肠杆菌病确诊的一种补充性调查法。在发生新生仔猪大肠杆菌病的仔猪体内，我们可以观察到F4阳性肠毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)附着于空肠和回肠的大部分肠黏膜上皮细胞刷状缘膜上，而其他ETEC主要附着于空肠远端或回肠。其他变化包括血管充血、出血和炎性细胞(肠道固有层中的中性粒细胞和巨噬细胞)数量增多。ETEC型断奶仔猪腹泻(Post-weaning Diarrhoea，PWD)的显微病变以在回肠和很少一直在空肠段顶层绒毛上皮细胞的斑点(patch)上观察到的细菌层为特征。在肠道固有层浅表部位可观察到绒毛轻度萎缩和中性粒细胞数量增多。免疫组织化学法和原位杂交荧光法可以用作确诊观察到的显微病变的病原学方法。

表3列出了用于鉴定分离自新生仔猪和断奶仔猪大肠杆菌病病例的大肠杆菌菌株的标准和方法。

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3 鉴别诊断(表4)

猪暴发的肠道病通常是由多因子引起的。注重诊断和随后的控制措施而不考虑所有可能的鉴别诊断或涉及的多种因素可能会误导执业兽医师的判断。新生仔猪和断奶仔猪大肠杆菌病的诊断评价要求采用相似的标准诊断程序。如果剖检时观察到的病变非常具有指向性，那么诊断路径很容易执行，这适用于肠型大肠杆菌病。根据记录到的病理损伤，细菌学检测通常可以对得到的初步结论轻易确诊。仔猪断奶前的腹泻比断奶后的腹泻更易直接地鉴定、治疗和预防。尤其是ETEC造成的新生仔猪腹泻必须与引发腹泻的其他病原相区别，如艰难梭菌、A型和C型产气荚膜梭状芽孢杆菌、肠内冠状病毒[传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)]和轮状病毒(A群、B群和C群)。对于年龄大于7日龄的仔猪，它们的鉴别诊断还应该考虑由猪等孢子球虫造成的球虫病。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

ETEC造成的断奶仔猪腹泻应与已经在仔猪中确诊过的其他腹泻的病因相区别，如肠道致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠内冠状病毒(TGEV、PEDV)、轮状病毒(A群、B群和C群)、沙门氏菌、引发增生性肠炎的胞内劳森菌和短螺旋体属(表5)。

猪肠型大肠杆菌病的诊断方法

原题名：Swine enteric colibacillosis: diagnosis, therapy and antimicrobial resistance (英文)（资料来源：Andrea Luppi(意大利)，贾良梁译，《国外畜牧学—猪与禽》2018年10月刊）