猪繁殖和呼吸综合症诊断方法

4.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等。

4.1.2试剂

4.1.2.1 IPMA诊断板的制备：见附录B。　　4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用清稀释至工作浓度。

4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自行配制。

4.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内。4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。

4.2操作方法

略。

4.2.1 取已作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔（V+）其后的1个未感染细胞孔（V-）内每孔50μL，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4℃条件下过夜。

4.2.2 弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100μL，每次1min~3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。

4.2.3 每孔加入工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50μL，封板后放在保温盒内于37℃恒温箱中感作60min。

4.2.4 弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2。

4.2.5 每孔加入显色/底物溶液50μL，封板于室恒（180℃~24℃）下感作30min。

4.2.6 弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水低上轻轻拍干，待检。

4.3 结果判定与解释

将IPMA诊断板置于倒置显微镜判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔（P·V+）和未感染细胞孔（P·V-）均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔（P·V+）应呈典型阳性反应，未感染细胞孔（P·V-）应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔（N·V+）和感染细胞孔（N·V-）均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞孔（V-）不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA（+）；无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA（-）。IPMA（+）者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。　　5 间接免疫荧光试验（IFA）

5.1材料准备

5.1.1器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。

5.1.2试剂

5.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录B。

5.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄（FITC）结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。

5.1.3 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。

5.2 操作方法

5.2.1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100μL PBS液洗一次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。

5.2.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后感染细胞孔1个，每孔100μL，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37℃恒温箱中感作45min。

5.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100μL，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。

5.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50μL，在37℃恒温箱中感作45min。

5.3 荧光显微镜检查及判定与解释

荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OG1或GG9），在5倍~10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔（P·V+）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（P·V-）不应出现特异性荧光，标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔（N·V+）和未感染细胞孔（N·V-）均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔（C·V-）不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔（N·V+）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性。　　6 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）

6.1 材料准备

6.1.1 器材：96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿等。

6.1.2 试剂

6.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。

6.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。

6.1.2.3 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。

6.1.2.4 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。

6.1.3 样品：采集被检猪血液分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。

6.2操作方法　　参考图2 6.2.1 包被抗原：取96孔平底微量反应，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工浓度的对照抗原，每孔100μL（参照图2），封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min，再移置4℃冰箱内过夜。

6.2.2 洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔100μL，洗涤3次，每次1min.在吸水纸上轻轻拍干。

6.2.3 封闭：每孔加入封闭液100μL，封板后置保温盒内37℃恒温箱感作60min.

6.2.4 洗涤：方法同6.2.2

6.2.5 加血清：反应板按图2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100μL。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感作15min。

6.2.6 洗板：方法同6.2.2。

6.2.7 加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100μL，封板，放保温盒内置37℃恒温箱中感作15min。

6.2.8 洗板：方法同6.2.2

6.2.9 加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μL，封板，在37℃恒温箱中感作15min。

6.2.10 加终止液：每孔添加终止液100μL终止反应。

6.3 光密度（OD）值测定与计算

6.3.1 OD值测定：在酶标测定仪上用λ=650nm读取反应板各孔溶液的OD值，记入专用表格。

6.3.2 OD值计算

按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。

标准阳性血清（P）与病毒抗原（V）反应的均值P·V(OD650)按式（1）计算：

P·V(OD650)=（OD650）+B1（OD650）]/2……………………（1）

标准阳性血清（P）与对照抗原（C）反应的均值P·C(OD650)按式（2）计算：

P·V(OD650)=（OD650）+B2（OD650）]/2……………………（2）

标准阴性血清（N）与病毒抗原（V）V(OD650)按式（3）计算：

N·V(OD650)=（OD650）+D1（OD650）]/2……………………（3）

被检血清（S）与病毒抗原（V）反应的均值S. V(OD650)按式(4)计算:

S·V(OD650)=（OD650）+E1（OD650）]/2 (以S1血清为例)………………（4）

被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S. C(OD650)按式(5)计算:

S·V(OD650)=（OD650）+E1（OD650）]/2 (以S1血清为例)………………（5）

6.3.3 按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P：

S/P=/……（6）

6.4 结果的判定与解释

6.4.1 有效性判定:P·V (OD650)与N·V(OD650)的差值必须大于或等于0.150时,才可进行结果判定.否则,本次试验无效.

6.4.2 判定标准与解释

A) S/P比值小于0.3,判定为PRRS病毒抗体阴性,记作间接ELISA(一).B) S/P比值大于或等于0.3,小于0.4,判定为疑似,记作间接ELISA(±).C) S/P比值大于或等于0.4,判定为PRRS病毒抗体阳性,记作间接ELISA(+).

间接ELISA(+)者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体.7 血清中和试验(SN)

7.1 材料准备

7.1.1 器材:96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳（CO2）-恒温箱、倒置显微镜等。

7.1.2 病毒:美洲标准株ATTCVR-2332或欧洲标准株LV,由国家指定单位提供.使用前按附录C方法滴定病毒效价后,用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养液(pH7.2)将其稀释至200TCID50/25μL,作为工作病毒液.

7.1.3 细胞:MARC-145或HS2H传代细胞,由国家指定单位提供.使用时,用细胞分散液消化、分散细胞,计数,再用EMEM营养液(含犊牛血清10%,青霉素100IU/ml,链毒素100μg/mL,pH=7.2)稀释至106细胞/ml.

7.1.4 试剂

7.1.4.1 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清,由国家指定单位提供,使用前经56℃灭活30min,并按说明书规定进行稀释.

7.1.5 样品:无菌采集被检猪血清,血清必须新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃保存或立即送检，检测的经56℃灭活30min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2~3周时采集为宜。

7.2 操作方法

图略。

7.2.1 加营养液:取96孔细胞培养液,编号,于各血清检测孔内加入EMEM营养液(含10%犊牛血清、100IU/ml青霉素、100μg /ml链霉素，pH=7.2)25μl,细胞对照区各孔加50μl,病毒对照区各孔不加.

7.2.2 加被检血清:单头微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血清,在各排头两孔各加入25μl。每份被检血清须平行安排两排，即每个稀释度两孔。

7.2.3 稀释被检血清:从第2列开始依次向后将被检血清作倍比稀释, 使第2、3、4、5、6列孔的血清稀释倍数依次为21、22、23、24、25。稀释时，用8头微量取样器先在第2列孔内吹吸数次,充分混匀后吸取25μl移入第3列,同前混匀后取25μl移入第4列,以下依次进行.当第6列各孔混匀后,各吸取25μl弃去.稀释过程中切勿产生气泡.

7.2.4 稀释对照血清:同7.2.3法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀释.

7.2.5 加病毒液:除血清性对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加用含20%健康猪新鲜血清EMEM营养液，将病毒液稀释成200TCID50/25μL工作病毒液25μl。

7.2.6病毒对照：取灭菌试管4支，用20%健康猪新鲜血清EMEM营养液（pH7.2）将病毒液稀释至含毒量为200TCID50/25μL、20TCID50/25μL、2TCID50/25μL和0.2TCID50/25μL4个滴度,然后参照图3各取25μL加入相应的孔内（每个滴度4个孔），再于各孔内入25μl2倍稀释的标准阴性血清.此时,病毒浓度分别降为100TCID50/25μL、10TCID50/25μL、1TCID50/25μL和0.1TCID50/25μL.

7.2.7 中和感作:将培养板放入37℃的5%二氧化碳保湿恒湿箱中感作60min.

7.2.8 添加细胞:于每孔内加入配制好的MARC-145或HS2H细胞悬液50μL.

7.2.9 培养：封板后，放入37℃的5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。

7.3 观察与记录

在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用（CPE）。每天观察一次，连续观察5天，并将观察结果记入专用登记表内。PRRS病毒在MARC-145或HS2H细胞上生长，引起的CPE主要是：细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。

7.4 中和效价计算和结果判定

在各对照组合下述要求时，本次中和试验才成立。

a）病毒对照：病毒浓度为0.1TCID50的各孔不应出现任何CPE，100TCID50的各孔均应出现CPE。　　b）血清毒性对照：相当于试验中最低稀释度（本标准中为2倍）的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。　　c）细胞对照：在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。　　d）阳性血清对照：试验中所显示的能抑制CPE出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差1个滴度以上。　　e）阴性血清对照：各稀释度幸免应出CPE。

对被检血清的中和效价进行计算。其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现CPE的血清最高稀释倍数的倒数。血清中和效价大于或等于1：4，判定为血清中和试验阳性，记作SN（+）；小于1：4，判为阳记，记作SN（—）。SM（+）表示被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。

8 综合判定

当在临床上怀疑有PRRS病毒感染时，可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。对于未接种过PRRS疫苗或已超疫苗免疫期的猪，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRS病毒感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRS病毒感染猪；当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为PRRS病毒感染猪。　　附录A

血清学试验中试剂的配制

A1 PBS液（0.01mol/L PBS,pH=7.2）用于IFA

氯化钠（NaCl） 8g；氯化钾（KCl） 0.2g；碳酸氢钠（NaHCO3）1.15g；磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g；三蒸水加至 1000ml；保存于4℃备用。

A2 洗涤液（0.01mol/L PBS-0.05%吐温-20，PH=7.4）用于IPMA和间接ELISA

磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g；磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.9g；氯化钠（NaCl） 8.0g；氯化钾（KCl） 0.2g；吐温-20 0.5ml；三蒸水加至 1000ml；现用现配。

A3抗原稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）用于间接ELISA

碳酸钠（Na2CO3） 1.59g；碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93g；三蒸水加至 1000ml；44℃保存，一周内用完。

A4 血清稀释液用于IPMA和ELISA

为含1%犊牛血清的“A1”液。

A5 封闭液用于间接ELISA

为含1%犊牛血清白蛋白或10%马血清的“A1”液。

A6 显色/底物溶液用于IPMA

A6.1 AEC贮存液

称取氨乙基咔唑（3-amino-9-ethy1-earbazole，AEC）4mg溶于二甲基甲酰胺（N，N-dimethy-for-mamid）4mL中，充分溶解后置4℃避光保存。

A6.2 乙酸钠溶液

乙酸钠（CH3COONa） 4.15g加三馏水至 1000mL用冰乙酸调整至pH=5.0

A6.3 乙酸盐缓冲液

冰乙酸（CH3COOH） 12.8mL；乙酸钠溶液 35.2mL

A6.4 显示/底物溶液（AEC-H2O2）

乙酸盐缓冲液 19mL；AEC贮存液 1mL；30%过氧化氢（H2O2） 0.067mL；充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。现用现配。

A7 底物溶液用于间接ELISA

A7.1 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液

柠檬酸（C6H8O7） 1.92g 加三馏水至 100mL

A7.2 0.1ml/L磷酸氢二钠溶液

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 3.58g 加三馏水至 100mL

A7.3 底物溶液（TMB-H2O2）

0.1 mol/L柠酸溶液 33.0mL；0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液 66.0mL；四甲基联苯胺（TMB） 40.0mg；30%过氧化氢（H2O2） 1.5mL；充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配。

A8 终止液用于间接ELISA

1 mol/L 氢氟酸（HF）溶液　　附录B

猪肺泡巨噬细胞（PAM）制备、鉴定、保存与复苏

B1 试剂准备

B1.1 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

a）原液甲

氯化钠（NaCl） 8.00g；氯化钾（KCl） 0.20g；磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.15g；磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.20g；溶于500mL三馏水中，再加入5mL0.4%酚红液，加三馏水至800mL，56kPa20min灭菌备用。

）原液乙

氯化镁（MgCl2·6H2O） 0.1g；加三馏水至 100mL；56kPa20min 灭菌备用；

c)原液丙

氯化钙（CaCl2）溶于100mL三馏水中，56kPa20min灭菌备用。

c）工作液

原液甲 8份；原液乙 1份；原液丙 1份；充分混合后备用。必要时，可适量加入抗生素（青霉素103IU/mL、链霉素103μg/mL、庆大霉素103μg/mL），不加制霉菌素。

B1.2 细胞生长液

含10%犊牛血清的RPMI1640营养液（含青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL、庆大霉素50μg/mL）。

B1.3 细胞冻存液

取细胞生长液8.0mL，加入分析纯二甲基亚砜（DMSO）2.0mL，混合均匀。不加制霉菌素。

B2 PAM的制备

联4~8周龄的SPF猪或被证实无PRRS病毒感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用约200mL PBS液从气管灌入肺，挤压灌洗3~4次，收集灌洗液，1000×g离心10min，得到的巨筮细胞泥用PBS液再悬浮和离心洗涤2~3次。最后的细胞泥用50mL细胞生长液悬浮，进行细胞计数，用细胞生长液稀释使用细胞浓度达4×107/1.5mL。所得新鲜巨噬细胞立即应用或定量分装后冻存。

B3 PAM的冻存

取细胞浓度为8×107/1.5mL的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摇。加毕，立即用聚苯乙烯管分装，每管1.5/mL，放—70℃过夜，转入液氮中保存。

液氮保存各批巨噬细胞，不可混合。

B4 PAM的批次试验

每批巨噬细胞应检验合格后再使用。方法是，在96孔细胞培养板上用已知滴度的标准病毒感染巨噬细胞，并用标准的阳性血清和阴性血清进行IPMA或IFA测定。只有能支持特定滴度的标准病毒良好生长的巨噬细胞，方可用于试验。

B5 PAM的复苏

从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水（38℃左右）中迅速解冻。将细胞移入10倍量的RPMI1640营养液（pH=7.2）中，1000×g离心10min，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，计数，稀释至要求的细胞浓度后，即可使用。

B6 IPMA诊断板的制备

用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5×104细胞/mL，加入PRRS美洲或欧洲标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，混合后接种96孔细胞培养板1、2、4、5、7、8、10、11列的各孔内，每孔加100μL。在3、6、9、12列的各孔内加100μL未感染病毒细胞悬液。把细胞培养板放在37℃、5%CO2培养箱中培养48h~72h.。当细胞出现20%CPE时，弃去培养液，用PBS液（100μL/孔）洗一次，每孔加80%丙酮水溶液100μL，把板置于4℃条件下固定30min。弃去丙酮液，在纸巾上拍干，放置室温下完全干燥后—70℃保存备用。

B7 IFA诊断板的制备

用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5×104细胞/mL，加入PRRS标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，加到96孔细胞培养板的1、2、4、5、7、8、10、11列各孔内，每孔100μL。在3、6、9、12列各孔内加入未感染病毒细胞悬液100μL。将该细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养60h~68h。弃去培养液，每孔加入预冷的无水乙醇100μL，将此细胞培养板置于—20℃或—70℃冰箱中备用。　　附寻C

猪繁殖和呼吸综合症病毒TCID50测定

C1 材料准备

C1.1 器材：48孔细胞培养板2块、微量移液器、恒温箱、倒置显微镜等。

C1.2 病毒：美洲型标准株ATCC VR-2332或欧洲型标准株LV，向农业部指定单位索取。

C1.3 细胞：MARC-145或HS2H传代细胞，向农业部指定单位索取。使用时，细胞经细胞分散液消化分散后计数，用EMEM营养液（含犊牛血清10%、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL，pH7.2）稀释至106细胞/mL。

C2 操作方法

C2.1 稀释病毒：取洁净无菌的48孔细胞培养板，于第1孔加EMEM营养液200μL，其余各孔加225μL；换吸头，再于排头第1孔添加病毒液50μL，将混合液充分混匀。换吸头，吸取25μL移于第2孔，混合。更换吸头，再吸取25μL加入第3孔。连续如此操作至第10列，作成10个连接10倍的稀释液，使病毒稀释度依次为5×100、5×101、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108、5×109。改用多头微量取样器吸取每一稀释度的病毒液50μL移入另一块48孔（或96孔）细胞培养板，每个稀释度的病毒液平多移种4孔。剩下的各孔加50μFMEM营养液，留作细胞对照。

C2.2 添加细胞：于细胞培养板各孔内添加50μL工作浓度的细胞悬液。此时，病毒稀释度依次变为101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010。

C2.3 培养：封板后，放37℃5%二氧化碳保温恒温箱内培养。

C3 观察与TCID50计算

在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用（CPE）。每天观察一次，并将观察结果记入专用登记表内。观察天数为直至出现CPE终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征。

用Reed-Muench法、内插法或Karber法计算该病毒培养物的TCID50/0.05mL。