复方柴菊乳酸菌毒性试验

我国微生态制剂的研究起源于20世纪70年代末至80年代初，90年代以后进入产业化研制、开发及大规模生产期，近年来动物微生态制剂得到了空前发展在畜牧生产中的应用也日益广泛。微生态制剂应用广泛，兼有养生和保护功能，能起到“已病辅治、未病防病、无病保健”的重要作用。发酵中药是将中药饮片粉末或中药提取液添加优选的肠道益生菌菌群或菌种，利用微生态学中微生物降解、生物发酵、消化分解等方式，对中药有效成分进行生物学转化，将中草药中的有效成分和活性物质最大限度地释放出来，将动物难以消化吸收的中药大分子物质经微生物转化和修饰成为能够被机体肠道直接吸收的小分子成分，还可产生各种不同的酶，从而补充调整或维持动物肠道内微生态平衡，促进动物生长发育，缩短饲养周期，提高饲料报酬率，增强药效和降低饲养成本，达到防病、治病、促进健康和提高生产性能的目的。一、柴胡的来源功效及现状柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum?chinense?DC.或狭叶柴胡Bupleurum?scorzonerifolium?Willd.的干燥根。性微寒味辛、苦，归肝、胆、肺经。具有发表和里，升举阳气，舒肝解郁之功能。主治感冒发热，寒热往来，脾虚久泻，子官垂脱，脱肛。柴胡中含有柴胡皂苷、甾醇、挥发油（柴胡醇、丁香酚等）、脂肪酸（油酸、亚麻油酸、棕榈酸、硬脂酸等）、多糖、黄酮、多元醇、香豆素和微量元素等成份，其中柴胡皂苷为柴胡皂苷a（C42H68O13）和柴胡皂苷d（C42H68O13）。柴胡属(bupleurum?L.)植物是伞形科(umbelliferae)植物中的大属之一,据报道全世界有柴胡属植物约200种，我国已报道有42种，17种变种及7种变型，是一种世界性的植物药，近来研究发现柴胡具有抗病毒感染、抗溃疡、抗毒素、免疫调节和保肝等多种作用。二、紫雏菊的来源功效及现状紫雏菊（Echinacea?Purpurea）为菊科多年生草本植物紫锥菊的干燥根、茎叶和花，9月采收，除去杂质，低温干燥。别名紫松果菊、紫锥菊、紫锥花，原产美洲，药用价值高，因其头状花序形似松果而得名，干燥根形似川木香，细度条形，棕黑色，有油性，淡而清香，有甜味。紫雏菊有效成分为酚类化合物，如紫锥菊皂甙(Echinacoside)、毛蕊糖甙(Verbascoside)、菊苣酸(Cichoric?acid)、咖啡酸(Cafferic?acid)、绿原酸(Chlorogenic?acid)、异氯原酸等，还含有多种烷基胺、黄酮、多糖和少量挥发油，主要成分为菊苣酸和多酚，分子式为C22H18O12，分子量为474.37，菊苣酸能抑制透明质酸酶和HIV-1整合酶,并在体内体外具有细胞吞噬促进作用和抗病毒活性，具有保肝、抗菌、抗感染、抗过敏等作用。三、乳酸菌的来源功效及现状乳酸菌（lactic?acid?bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应和突然的应急反应等产生作用。四、复方柴菊乳酸菌发酵产物的毒性试验本实验以柴胡、紫雏菊混合粉末作为乳酸菌固态发酵的基质，获得了富含粗多糖、粗蛋白、乳酸菌等功能性成分的复方柴菊乳酸菌发酵产物。为进一步将发酵产物开发为可应用于畜禽动物疾病预防和辅助治疗的动物营养素等产品，以小鼠为实验对象，对复方柴菊乳酸菌发酵中药产物进行急性和亚急性毒性实验研究。1．材料与方法仪器与试剂??BC-3000全自动三分群血细胞分析仪，武汉赛尔利斯科技贸易有限公司；synergy2型多功能酶标仪：美国Biotek公司；HM550型冷冻切片机：上海中威医疗设备技术服务有限公司；激光共聚焦显微镜：北京美亚先科技有限公司；试剂盒：谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、白蛋白（溴甲酚绿比色法）、蛋白定量（双缩脲法）、总胆固醇、肌酐、尿素氮（BUN）、血糖（葡萄糖）、甘油三酯：南京建成试剂盒。动物??选于北京华阜康生物科技股份有限公司的SPF级ICR小鼠，动物合格证编号：scxk（京）2009-0004，根据实验需要选择相应性别和体重的动物，动物室内温度为23℃±2℃，相对湿度为40%-60%。样品的制备??复方柴菊乳酸菌发酵中药产物为本实验室利用柴胡、紫雏菊混合粉末经乳酸菌进行固态发酵制得，发酵物经烘干、粉碎所得的超微粉。采用混饲的方法对动物进行给药。实验方法急性毒性试验??ICR小鼠40只，养一周后体重在19.0-23.0g，按照体重正态分布分为空白组和实验组，每组各20只，雌雄各半，试验前禁食16小时，不禁水。根据试验采用混饲的方法对动物进行给药，按最大耐受量（MTD）法设计实验组给药量为35g/kg?bw，空白对照给予等量的全价饲料，给料后半小时内采食完，连续7天，每天上午观察记录小鼠的体重变化、饮食、外观、分泌物、排泄物及死亡状况，7天后对未死亡小鼠进行大体解剖观察。实验结束时，将小鼠称重、摘除眼球放血处死，将小鼠浸泡在75%乙醇溶液中3分钟，消毒后解剖。用肉眼观察其有无病变，摘取心、肝、脾、肺、肾称重，按照公式【脏器系数=（脏器重/体重）×1000】计算脏器系数。亚急性毒性试验??ICR小鼠40只，养一周后体重在19.0-23.0g，按照体重正态分布分为1个空白组和3个实验组，实验组分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各10只，雌雄各半，低、中、高实验组剂量分别为5g/kg?bw、10g/kg?bw、15g/kg?bw，按照采食量与体重关系混饲给药，空白组给予对应的全价饲料，连续给药35天，小鼠自由采食和饮水，每天观察记录小鼠的一般情况。测量计算小鼠的平均增重、平均日食量、饲料利用率。实验结束时摘眼球取血，测定小鼠的血常规、生化指标、主要脏器的大体解剖及组织病理学检查。小鼠饲料利用率的测定??每天记录小鼠的采食量，每周末称量各组小鼠体重，通过饲料利用率公式【饲料利用率=平均日增重/平均日食量】，计算小鼠饲料利用率。小鼠血常规的测定??实验结束时摘眼球取血，将血液滴入装有EDTAK2抗凝剂的真空采血管中，取约100ul，使用BC-3000全自动三分群血细胞分析仪进行血常规分析检测。小鼠血清生化指标的测定??实验结束时摘眼球取血，将血液滴入离心管中，静置，待血清析出后，离心，取血清，按照试剂盒使用说明书分别测定血清中谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、白蛋白、蛋白定量、总胆固醇、肌酐、尿素氮（BUN）、血糖、甘油三酯各生化指标含量。组织病理学观察??实验结束时将小鼠摘眼球处死，进行大体解剖检查，观察组织器官有无明显的病理变化。同时取心、肝、脾、肺、肾、睾丸或卵巢组织，使用HM550型冷冻切片机、HE染色，激光共聚焦显微镜对切片观察并照相，进行组织切片病理组织学形态研究。TSS统计学分析??数据采用X±S表示，应用软件对数据进行方差统计分析。2．实验结果急性毒性试验小鼠日常表现，一次给药后，每天上午观察记录小鼠的日常表现。实验组小鼠皮毛顺滑亮泽、活动兴奋、排泄物和分泌物无异常，未发现死亡小鼠，与空白对照组相比较无异常，实验组小鼠无中毒症状。大体解剖实验数据??实验结束后将小鼠摘眼球处死进行大体解剖，对小鼠主要脏器器官用肉眼观察有无病理异常。结果未发现任何病理性变化。急性毒性试验小鼠脏器系数（见表1）表1急性毒性试验小鼠脏器系数性别组别动物数量（只）剂量（g/kg）心肝脾肺肾雌实验组10355.33±0.7251.44±6.814.90±0.828.50±2.3611.80±1.16空白组1005.39±0.8053.22±2.625.10±0.437.92±1.5112.18±0.66雄实验组10354.88±0.5054.36±7.554.61±1.516.36±1.1415.39±2.56空白组1004.66±0.4153.61±4.594.09±1.286.96±1.2115.09±1.71急性毒性试验小鼠脏器系数由表1可以看出，实验组与空白组没有明显差异，表明复方柴菊乳酸菌发酵中药产物为实际无毒物质。根据毒理学评价标准，LD50>35g/kg?bw，可不必测半数致死量（LD50），雌、雄实验组小鼠的脏器系数与空白组比较，均无显著性差异（P>0.05）。亚急性毒性试验小鼠饲料利用率的测定（见表2）表2复方柴菊乳酸菌发酵中药产物对小鼠饲料利用率的影响性别组别剂量（g/kg）平均日增重/g平均日采食量/g饲料利用率%雌高剂量组150.294.925.89中剂量组100.274.825.60低剂量组50.244.695.12空白组00.144.603.04雄高剂量组150.445.887.48中剂量组100.425.727.34低剂量组50.385.227.28空白组00.245.804.14亚急性毒性试验由表2可以看出，各剂量实验组与空白组小鼠平均日采食量相当，平均日增重中实验组明显高于空白组，实验组饲料利用率明显高于空白组饲料利用率。小鼠血常规的测定数据与分析（见表3）表3复方柴菊乳酸菌发酵中药产物对小鼠血常规的影响性别组别剂量g/kg血红蛋白Hgb(g/L)红细胞计数RBC(1012个/L)白细胞计数WBC(109个/L)中性粒细胞NEUT%淋巴细胞LYM%红细胞压积HCT（L/L）雌高剂量组15116.3±20.395.62±0.543.67±0.5269.50±8.5127.06±8.010.28±0.01中剂量组10122.7±7.885.91±0.343.04±0.7967.36±4.5929.00±4.090.28±0.02低剂量组5121.3±7.165.88±0.083.41±1.1970.22±3.5927.81±4.030.29±0.02空白组0120.0±8.135.83±0.423.24±0.6967.01±5.8129.83±6.550.29±0.01雄高剂量组15119.7±6.286.07±0.182.85±0.8467.29±5.3329.42±6.490.28±0.04中剂量组10128.2±6.166.35±0.292.99±0.3668.35±3.7630.69±4.110.31±0.02低剂量组5118.9±4.146.10±0.092.59±0.6366.43±3.1432.18±1.100.30±0.01空白组0117.4±5.866.06±0.272.71±0.6466.09±3.8431.30±4.000.29±0.04小鼠血常规的测定结果表3可见亚急性毒性试验中，各剂量实验组雌雄小鼠的血常规数据指标与空白组比较，均无显著性差异（P>0.05）。小鼠血清生化指标数据与分析（见表4）表4复方柴菊乳酸菌发酵中药产物对小鼠血清生化指标的影响性别组别剂量g/kg谷丙转氨酶ALT(U/L)总胆固醇CHO(mmol/L)谷草转氨酶AST(U/L)甘油三酯TG(mmol/L)血糖GLU(mmol/L)总蛋白TP(mg/ml)白蛋白ALB（g/L）雌高剂量组1521.36±9.340.68±0.2060.30±26.330.37±0.100.41±0.0972.30±8.3136.71±5.12中剂量组1026.34±9.780.75±0.2162.30±22.600.46±0.080.38±0.1669.50±6.8638.01±2.18低剂量组523.55±9.560.68±0.1563.80±20.640.46±0.060.41±0.0270.30±5.6039.04±3.02空白组027.17±8.610.76±0.0760.30±24.900.46±0.040.31±0.1064.90±9.0636.46±6.18雄高剂量组1530.30±8.900.82±0.1273.01±22.040.59±0.160.49±0.0466.90±3.8736.42±3.82中剂量组1028.93±9.600.75±0.0859.90±26.100.54±0.100.49±0.1066.82±4.1634.40±3.32低剂量组526.62±9.400.71±0.1349.60±11.000.56±0.120.52±0.1067.10±3.9035.52±3.91空白组030.01±4.500.86±0.1566.80±15.070.58±0.080.51±0.0768.70±3.6936.02±3.12小鼠血清生化指标结果表4可见亚急性毒性试验中，各剂量实验组雌雄小鼠的血清生化指标与空白组比较，均无显著性差异（P>0.05）。小鼠组织病理学观察分析，实验结束时将小鼠进行大体解剖检查，未发现任何组织器官的病理异常变化。对高剂量组小鼠心、肝、脾、肺、肾、睾丸或卵巢组织进行组织切片观察，均未发现因食用受试物而引起的中毒性病变及变化。3.讨论通过对复方柴菊乳酸菌发酵中药产物进行的急性和亚急性毒性实验研究表明，复方柴菊乳酸菌发酵中药产物为绿色、安全、天然、无毒的营养物，可放心的用于畜禽等动物营养增强剂及饲料添加剂中。五、国内外市场分析及未来展望中药+活性乳酸菌，这一领先的动物保健理念改写了养殖业对抗生素的依赖，以及滥用抗生素导致的病菌耐药、无药可用的局面。真正体现了预防为主、防大于治的正确养殖观念。使全国首创的中药固体发酵制剂，再一次自我超越，必将引领微生态领域整体技术水平的提升。微生态活菌中药发酵制剂作为公认的饲用抗生素最佳替代品，使畜牧业养殖回归生态化道路。乳酸菌作为动物肠道的原籍菌，几乎是所有微生态制剂中需求量最大，发挥作用最理想的菌种，美国科学家预言：“21世纪将是乳酸菌的世纪”。活性乳酸菌发酵中药微生态制剂才是养殖效益的根本保障。作者简介：要瑞丽，女，（1975.11），高级工程师、执业药师，总工程师，毕业于沈阳药科大学药学专业和天津南开大学生物技术专业，本科，长期从事新药的研究和开发。   关键词： 复方柴菊乳酸菌毒性试验 药品试验